Влияние метода консервации проб активного ила на бактериальную структуру

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Микроорганизмы активного ила используются для решения важнейшей экологической проблемы: очистки сточных вод. Механизм работы промышленных установок основан как на биологических особенностях метаболизма отдельных представителей микробиоценоза активного ила, так и на закономерностях совместного сосуществования разных видов микроорганизмов. Поэтому одной из главных задач современной науки является изучение активного ила как сообщества тесно взаимосвязанных групп организмов, исследование взаимодействия микроорганизмов между собой и с компонентами окружающей среды. А это зачастую требует больших временных затрат, поэтому возникает необходимость торможения и фиксирования живых объектов путем консервации проб. Цель: исследование влияния различных методов консервации проб на клеточные структуры прокариотических представителей микросообщества активного ила.Задачи:- изучить и проанализировать научную литературу по теме исследования;- охарактеризовать микросообщество активного ила как природную систему взаимодействующих компонентов;- изучить влияние отдельных методов консервации проб на бактериальную структуру и метаболизм представителей активного ила. 1.Микросообщество активного илаАктивный ил - биоценоз зоогенных скоплений (колоний) бактерий и простейших организмов, которые участвуют в очистке сточных вод. Активный ил представляет собой хлопья коричнево-бурого цвета, состоящие в основном из бактериальных клеток, на поверхности которых и между ними находятся разнообразные простейшие организмы. При аэрации воды создаются оптимальные условия для их жизнедеятельности и повышения скорости окисления органических веществ. Активный ил образуется при длительной аэрации биологической плёнки биофильтров или бытовых сточный вод. Качественный и количественный состав активного ила зависит от состава органических примесей воды. Обычно содержание бактерий в активном иле колеблется от 108 до 1012 на 1 мл сухого вещества. В процессе очистки воды микроорганизмы образуют зооглеи – слизистые скопления, в которых преобладают кокковые и палочковидные формы бактерий. Основная роль в формировании способности активного ила к хлопьеобразованию принадлежит бактерии Zoogloea ramigera. Среди прокариот имеются группы аэробных бактерий, разлагающих все классы органических веществ. К ним относятся бактерии рода Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Pseudomonas, Actynomyces, Azotobacter, Corynebacterium, Desulfomonas, Pseudomonas, Sarcina, Bacillus, Micrococcus, Mycobacterium и др. [9]. В активном иле присутствуют фототрофные цианобактерии (родов Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis, Nostoc, Osillatoria), которые переходят к гетеротрофному питанию. Это приводит к утрате ими пигментов, и клетки цианобактерий становятся бесцветными.Кроме бактерий активный ил содержит актиномицеты (родов Gordonia, Rhodococcus) и грибы Trichosporon, Rhodotorula, Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillum, Fusarium и другие. Источником их попадания считают почву, воздух, сточные воды. Гораздо реже встречаются водоросли. Актиномицеты и микобактерии разлагают в основном безазотистые вещества – углеводороды, углеводы, жиры, органические кислоты. Дрожжи разлагают углеводы и кислоты, плесневые грибы – углеводы, спирты, кислоты, азотсодержащие органические соединения. В состав активного ила входят также разнообразные простейшие. Жгутиковые: Mastigophora, Flagellata, бесцветные жгутиконосцы (родов Bodo, Peranema), саркодовые: амебы (Amoeba limax, Amoeba proteus), раковинные амебы (родов Arcella, Centropyxis), голые амебы (род Pelomyxa), инфузории свободноплавающие (родов Colpidium, Oxytricha, Paramecium), брюхоресничные (Aspidisca), одиночные прикрепленные (сувойки Vorticella), колониальные прикрепленные (родов Epistylis, Opercularia), а также коловратки, водные клещи и нематоды. В зависимости от внешних условий в активном иле изменяется содержание различных видов простейших [7]. Микроорганизмы активного ила используются для очистки сточных вод. Все микроорганизмы развиваются в аэротенках - открытых железобетонных сооружениях, через которые проходит сточная вода, содержащая органические загрязнения и активный ил. Этому способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего в сооружение потоком подаваемого воздуха. Бактерии склеиваются в хлопья и выделяют ферменты, минерализующие органические загрязнения. Ил с хлопьями оседает, отделяясь от очищенной воды. Инфузории, жгутиковые, амебы, коловратки и другие мельчайшие животные, пожирая бактерии, неслипающиеся в хлопья, омолаживают бактериальную массу ила [3]. 2.Консервация проб активного илаВремя от отбора пробы до ее анализа необходимо сократить до минимума, к гидробиологическому анализу следует приступать не позднее 30-40 мин с момента взятия пробы, после того как температура смеси активного ила сравняется с температурой помещения. Пробы на гидрохимический анализ активного ила не консервируют. Пробы активного ила на определение дозы ила по объему и весу, илового индекса, прозрачности надиловой воды не рекомендуется хранить. Время от отбора пробы до ее анализа необходимо сократить до минимума, к анализу следует приступать сразу после отбора пробы, но не позднее 6 часов с момента взятия пробы, после того как температура смеси активного ила сравняется с температурой помещения. При невозможности проведения анализа в указанный срок пробы активного ила охлаждают до +4 °С. Хранить пробы следует не более 24 часов после отбора при температуре 3 - 4 °С [1].В случае долгосрочного и глубокого изучения параметров активного ила прибегают к консервации проб. Важными условиями работы с микроорганизмами являются поддержание штаммов в рабочем состоянии и сохранение их ценных свойств. Современные методы консервации оказываются относительно эффективными при поддержании лабораторных культур микроорганизмов [8]. Хранение микроорганизмов в течение длительного периода времени без утраты ценных свойств проводится методами, которые обеспечивают существенное торможение протекающих в них жизненных процессов. Эти методы основаны на способности микроорганизмов впадать в состояние анабиоза. Основными признаками анабиотического состояния являются: отсутствие или предельное торможение метаболизма, сохранение структуры в течение продолжительного времени, повышенная устойчивость против экстремальных факторов, способность восстанавливать процессы жизнедеятельности [5]. Выбор метода консервации конкретного объекта основывается на сохранении микроорганизмами жизнеспособности, морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической и генетической стабильности. Также нужно учитывать максимально возможное время хранения культуры и надежность данного метода, в том числе требования по обслуживанию в течение длительного времени. Состав среды, температура, условия аэрации и другие факторы оказывают существенное влияние на устойчивость микроорганизмов к стрессам, возникающим при длительном хранении. 3.Низкотемпературная консервация проб активного илаБольшинство бактерий способны длительно храниться в замороженном состоянии при низких (криогенных) температурах (температуры ниже минус 153 °С). Данную температуру хранения обеспечивают сжиженные газы – воздух, азот, неон, водород, гелий, которые находятся в специальных сосудах с хорошей теплоизоляцией, например, сосудах Дьюара. На практике чаще всего используется жидкий азот, имеющий температуру кипения 196°C, так как он более доступен и безопасен в использовании. Этим методом консервируют самые различные биоматериалы – актиномицеты, бактерии, дрожжи, грибы. Для повышения устойчивости микроорганизмов к воздействию низких температур применяются защитные вещества – криопротекторы, такие как пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин и др. [8].Эффективность сохранения микроорганизмами жизнеспособности и продуктивных свойств зависит от способов перевода и вывода их из состояния глубокого холодового анабиоза. В связи с этим для представителей различных родов, видов и штаммов микроорганизмов разрабатываются, при необходимости, индивидуальные эффективные технологии криоконсервирования, предусматривающие сохранение максимального количества жизнеспособных клеток без изменения их исходных свойств [10]. Изучение морфофункциональных свойств промышленных микроорганизмов, относящихся к родам Bacillus, Anabaena, Nostoc, хранившихся в жидком азоте в течение 15-20 лет, показало, что криоустойчивость данных микроорганизмов зависит от их таксономической принадлежности, физиологического состояния и режимов криоконсервирования. Большинство микроорганизмов обладало высокой криоустойчивостью в стационарной фазе роста. Увеличение концентрации цианобактерий в суспензии не приводило к повышению числа жизнеспособных клеток после криоконсервирования [10]При низкотемпературной консервации клетки подвергаются воздействию не только низких температур в диапазоне от -200С до -1960С, но и комплекса стрессовых физико-химических факторов, возникающих вследствие фазовых переходов воды: образование кристаллов льда, высокие концентрации внутри- и внеклеточных растворов, изменение рН среды, осмотические, концентрационные градиенты и др. Проведенные исследования поврежденных клеток бактерий показали, что основными причинами гибели клеток при замораживании и оттаивании являются повреждения мембранных структур кристаллами внутриклеточного льда и вторичные повреждения, вызванные высокими концентрациями внутри и внеклеточных растворов. Наблюдается гибель бактериальных клеток после дегидратации, которая может быть следствием денатурации белков, нуклеиновых кислот (повреждается геном), изменением структуры мембранных липидов, клеточной стенки [6].В физиологическом диапазоне температур биомембраны, сохраняя определенную структурную организацию, обладают жидкостностью, необходимой для функционирования, прежде всего, белковых компонентов, а также, вероятно, для обеспечения репарации спонтанно возникающих структурных дефектов. При температурах ниже физиологического диапазона компоненты биомембран «закристаллизовываются» в более жесткую, но и более хрупкую структуру. Такие мембраны нестабильны. У бактерий, в частности, это может проявляться в виде нарушений барьерных свойств цитоплазматических мембран при резком охлаждении от физиологических температур до температур, близких к 0С, без замораживания водной фазы. Это явление описано под названием «холодовой шок» [4].При снижении температуры и, как следствие, уровня гидратации наблюдаются изменения фазового состояния липидов клеточных мембран. При этом полярные головки липидов сближаются, что приводит к усилению взаимодействий между соседними углеводородными цепями, снижению текучести мембраны и переходу мембранных липидов в фазу геля при комнатной температуре. При размораживании мембранные липиды подвергаются обратному переходу от геля к жидкокристаллической фазе. Фазовые переходы мембранных липидов происходят не одновременно. Наличие липидов в разных фазах в течение длительного периода приводит к нарушению структуры и избирательной проницаемости мембран, что в условиях избытка воды может приводить к потере жизненно важных компонентов: ионов, солей, белков, нуклеотидов и, как следствие, гибели бактерий. Мембранные повреждения или структурные изменения мембран, которые происходят в результате длительного хранения, могут носить обратимый характер, если созданы оптимальные условия на всех стадиях процесса консервации [5]. При небольших скоростях охлаждения клеточной суспензии (медленная заморозка) кристаллизация воды происходит в первую очередь во внеклеточной среде, где концентрация растворенных веществ меньше, чем внутри клеток. По мере кристаллизации воды концентрация внеклеточного раствора повышается. Это приводит к частичной дегидратации клеток. Частичная дегидратация клеток и образование кристаллов льда приводит к сближению белковых молекул и образованию между ними дисульфидных связей путем окисления сульфигидрильных групп. При оттаивании межмолекулярные пространства белков увеличиваются, что приводит к развертыванию молекул белка и их денатурации [5]. Исследования показали, что при низкой скорости охлаждения (примерно 100С в минуту) большая часть клеток погибает на этапе замораживания от длительного воздействия холодового осмотического шока. Методами электронной криомикроскопии было показано, что при охлаждении клеточных суспензий до субнулевых температур между кристаллами льда формируются каналы со сконцентрированным замораживанием раствором и бактериальными клетками. По мере кристаллизации воды концентрация внеклеточного раствора повышается. Однако для большинства бактерий и прокариот при медленных скоростях охлаждения, но достаточных для предотвращения дегидратации несложно определить «зону выживаемости» или «окно выживаемости», т.е. найти оптимальную скорость охлаждения, при которой клетки сохраняют жизнеспособность [6].Низкотемпературная консервация используется для хранения отобранных проб с подходящим составом микроорганизмов в течение нескольких лет, когда нужно сохранить жизнеспособность необходимых отобранных культур микроорганизмов для последующего применения. Этот метод не требует сложного и громоздкого оборудования. Криоконсервация в жидком азоте применяется при необходимости сохранности проб на более длительные сроки с использованием сложного холодильного оборудования.4.Использование консервантовВ качестве консервантов для хранения (инкубации в течение нескольких суток) проб активного ила иногда применяют различные спирты. Добавление водных растворов спиртов различной концентрации (начиная с 0,01 мг спирта на 1 мл суспензии активного ила) к активному илу вызывает изменение общей дегидрогеназной активности микроорганизмов. Дегидрогеназная активность – показатель жизнеспособности бактерий, в том числе и анаэробных. Дегидрогеназы – ферменты, принимающие непосредственное участие в дыхании бактериальных клеток, осуществляя отрыв атомов водорода от органических субстратов и транспорт электронов в дыхательную цепь. Подъем активности ферментов практически в 2 раза провоцируется добавлением изопропанола. При внесении в пробу активного ила растворов метанола, этанола, бутанола, октанола или бензилового спирта – на 15-20%. Таким образом, существует зависимость между химическим строением ряда спиртов и их токсичностью для дегидрогеназ микроценоза активного ила. В частности, низшие нормальные спирты, кроме метанола, обладают меньшей токсичностью. Наибольшим сродством к ферментам обладают этанол, пропанол, изопропанол и изобутанол. Увеличение числа атомов углерода и гидроксильных групп, степени разветвления алкильного радикала приводит к повышению токсичности спирта для дегидрогеназ водных микроорганизмов. Бензиловый спирт, имеющий ароматическую структуру, более токсичен, чем циклогексанол, обладающий циклическим строением. Проведенные исследования показали, что добавление водных спиртовых растворов к активному илу в концентрации 2,0 мг/мл суспензии характеризуется либо положительной величиной относительной дегидрогеназной активности (в пробах с метанолом и с этанолом), либо свидетельствуют о начавшемся угнетении функционирования ферментов (для смесей, содержащих бутанол, изобутанол, пентанол, изопентанол). С повышением концентрации алифатических спиртов до определенного значения (концентрация насыщения) скорость ферментативной реакции возрастает. Дальнейшее повышение содержания спиртов приводит к субстратному ингибированию дегидрогеназ микробиоценоза активного ила [2] . Формалин, или раствор формальдегида, известный консервант биоматериала, сохраняющий клетки и ткани от разложения и воздействия микробов, также иногда используют для консервации живых проб микроорганизмов. Анализ динамики численности актиномицетов после внесения различных доз формальдегида показал ингибирующее действие на их размножение, отмечено непрерывное снижение количества актиномицетов в пробах с формальдегидом. Установлено также, что параллельно происходит увеличение содержания гетеротрофных бактерий после внесения в пробы доз формальдегида [11]. Формальдегид в малых дозах не оказывал негативного воздействия на бактериальные клетки. Наоборот, провоцировал усиленное размножение бактерий.Использование указанных консервантов позволяет сохранять пробы относительно непродолжительное время, на период изучения видового состава активного ила и выделения конкретной культуры микроорганизмов для изучения. Использование консервантов облегчает технический аспект исследований: отсутствует необходимость в сложном и дорогостоящем оборудовании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сделаем выводы по результатам проведенного исследования.1.Актвный ил – микробиоценоз разных систематических групп микроорганизмов, связанных трофическими и другими экологическими отношениями между собой и средой. Внутренние процессы саморегуляции микробиоценоза обеспечивают сохранность равновесия основных параметров сообщества. На этом основано использование активного ила в промышленных масштабах для очистки сточных вод.2.Для изучения активного ила производят отбор проб, которые, для большей точности и достоверности, рекомендуется исследовать в течение 24 часов. Но существуют и способы консервации проб активного ила: воздействие низких температур, использование консервантов.3.Более оптимальным способом является низкотемпературная консервация, мгновенная или постепенная заморозка микроорганизмов. 4.Использование любого метода консервации влечет в большей или меньшей степени негативные последствия для метаболизма микроорганизмов активного ила.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методика выполнения измерений массовой концентрации активного ила, ФР 1.31.2008.04397, Москва «АКВАРОС». – 20082. ШаталаевН.И., Расцветова Н.В., Медриш И.В. Влияние различных спиртов на дегидрогеназную активность активного ила. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011; том 13. №1(8): с. 2078-2080.3. Исследования природы Урала: Материалы Региональной студенческой научно-практической конференции / ФГБОУ ВПО Урал. гос. пед. ун-т. – Екатеринбург, 2014. – 163 с4. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология / Под ред. Калугина Е.В. – Киев: Наукова думка, 1994. – 432 с.5. Бекер М.Е., Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В., Звягинцев Д.Г., Абызов С.С., Аксенов С.И., Дамберг Б.Э., Лайвениекс М.Г., Шраго М.И., Белоус А.Ал., Пучков Е.О., Дуда В.И., Шевцов В.В., Феофилова Е.П., Зикаланис П.Б., Лозина-Лозинский Л.К., Сидякина Т.М., Бобин Н.Е., Николаев Г.Ал., Вентыня Э.Ю., Кулаев И.С., Жегунов Г.Ф., Говорунов И.Г., Алексеев А.Н., Успенская З.И., Кудряшов Б.Б., Горячев С.Н.. Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. Бекера М.Е. – Рига: Зинатне, 1987. – 240 с.6. Грачева И.В., Осин А.В., Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протективное действие защитных сред // Проблемы особо опасных инфекций. – 2016. - №3. – С. 5-12.7. Котов В.В., Нетесова Г.А. Химия и микробиология воды: учебное пособие – Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2008. – 320 с.8. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4(12). – С. 99-120.9. Широносов В.Г. Приготовление питьевой воды высшего качества: анализ и перспективы // Экология и промышленность России. - 2008. - № 3 .- С. 4-7.10. Цуцаева А.А., Ананьина А.Е., Балыбердина Л.М., Степанюк Л.В., Павленко Н.В. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов // Микробиология. – 2008. – Т.77. - №5. – С. 696-700.11. Ильина Н.А., Фуфаева Т.В., Казакова Н.А., Касаткина Н.М., Вилкова Е.А. Воздействие химических веществ (формальдегид и толуол) на почвенные микроорганизмы чернозема выщелоченного.// Самарский научный вестник. 2016. № 3 (16): с. 21-24.