Сравнительная оценка методов определения белка (глюкозы) в моче

Содержание
Введение…………………………………………………………………………...3
Глава 1. Методы определения белка в моче и их сравнительная характеристика.
1.1.Качественные и полуколичественные методы определения белка в моче..4
1.2.Количественные методы определения белка в моче……………………….7
Глава 2. Методы определения глюкозы в моче и их сравнительная характеристика.
2.1. Качественные методы определения глюкозы в моче……………………..10
2.2.Количественные методы определения глюкозы в моче…………………..11
Заключение………………………………………………………………………13
Список литературы………………………………………………………………14

Введение.
Протеинурия и глюкозурия- являются важными маркерами нарушения функции почек и метаболических реакций, происходящих в организме. В настоящее время ни один врач не обходится без использования результатов анализа мочи в постановке диагноза. По выраженности протеинурии можно отследить динамику протекания заболевания, степень поражения почек, эффективность проводимого лечения. Глюкозурия же позволяет диагностировать одно из распространённых в настоящее время заболеваний- сахарный диабет.
Существует несколько методов, позволяющих определить данные вещества в биологической жидкости, они имеют различную скорость и сложность выполнения, а также обладают неодинаковой эффективностью. Кроме того, методы разделяются по цели проводимого исследования на качественные, полуколичественные и количественные.
Актуальность работы: В настоящее время нет единого метода, по определению таких важных показателей, как уровень глюкозы и белка в моче. Необходимо выяснить, какие и всевозможных способов являются наилучшими, выявить самые эффективные и лёгкие по своему исполнению, чтобы улучшить качество диагностики различных заболеваний.
Задачи:
Изучить научную литературу по данной теме
Выявить все применяющиеся в медицине методы по определению белка в моче
Выявить все применяющиеся в медицине методы по определению глюкозы в моче
Провести сравнение выявленных методов анализа мочи
Сделать анализ и выводы по проделанной работе
Глава 1. Методы определения белка в моче и их сравнительная характеристика.
Качественные и полуколичественные методы определения белка в моче.
Все методы, целью которых является определение наличия белка в моче основаны на способности протеинов к денатурации при воздействии на них физических и химических факторов. После действия повреждающего агента на белок, если он имеется в данной жидкости, происходит выпадение осадка, либо помутнение мочи.
Есть особые условия, которые необходимо соблюдать в ходе подготовки мочи к данным исследованиям.
Реакция мочи должна быть кислой, если изначально была взята моча с щелочной реакцией-её подкисляют раствором уксусной кислоты.
Для достоверности проводимого исследования, необходимо сравнивать результаты в экспериментальной пробирке с контрольной порцией мочи.
Моча, для проводимого исследования, обязательно должна быть прозрачной. Если жидкость мутная- её пропускают через специальные фильтры.
Рассмотрим качественные методы определения белка:
1.Кольцевая проба Геллера
Для её проведения необходима концентрированная азотная кислота, либо реактив Ларионовой.
В пробирку отмеряют 1 мл концентрированной азотной кислоты, либо реактива Ларионовой, затем начинают аккуратно наслаивать мочу пипеткой по одной капле, по стенке пробирки до тех пор, пока количество реактива и мочи не станет равным. В это время необходимо поддерживать пробирку в одном положении, стараясь не смешивать жидкости. Если в жидкости есть белок, на границе раздела реактива и мочи появится белое кольцо. Наличие кольца оценивают на черном фоне с учётом времени его появления. Чувствительность пробы 0,033 г/л. Если в моче содержится данное количество белка, белое кольцо появляется на второй-третьей минуте.
2.Проба с использованием сульфосалициловой кислоты
Перед началом пробы необходимо приготовить реактив. Для этого смешивают 20 грамм салициловой кислоты с 20 мл концентрированной серной кислоты. Затем нагревают до температуры 95-100° C. Получившуюся смесь остужают и разбавляют водой до объема 150 мл. В итоге образуется двадцатипроцентный раствор сульфосалициловой кислоты.
Для определения наличия белка данным методом необходимо добавить к 3 мл мочи несколько капель сульфосалициловой кислоты. Если в жидкости имеется белок, произойдет помутнение, степень выраженности которого будет зависеть от изначального количества белка. Чтобы чётко увидеть даже самое малое помутнение необходимо сравнивать содержимое с контрольной пробиркой. Сравнение двух пробирок должно происходить на тёмном фоне при ярком свете. Результат пробы: реакция слабоположительная (+), положительная (++), резкоположительная (+++). Чувствительность пробы с сульфосалициловой кислотой 0,015 г/л.
В старые времена применялся также метод с кипячением, однако он является весьма неудобным в использовании и не обладает должной эффективностью, поэтому в настоящее время не используется.
Сравнительная характеристика:
Сначала стоит отметить, что качественные методы оценки не дают надёжных и точных результатов. Лучше всего использовать их для скрининга, с последующим количественным определением белка.
Кольцевая проба Геллера уступает по удобности и качественности сульфосалициловому методу, т.к. требует работы с концентрированной азотной кислотой, что весьма небезопасно, да и сама проба является достаточно трудоёмкой. Сульфосалициловую кислоту же можно закупить в готовом виде, а не получать перед проведением пробы. Также кольцо может появиться не только в моче, содержащей белок, а ещё и при взаимодействии с уратами. Проба Геллера часто может выдавать ложноположительные результаты, например, при повышенном содержании мочевой кислоты и мочевины.
Полуколичественные методы:
Метод Брандберга-Робертса-Стольникова,
Определение белка в моче диагностическими тест-полосками.
В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому наблюдаются все те же самые недостатки.
Очень широкое распространение получили диагностические полоски. Они содержат на себе индикатор, чаще всего бромфеноловый синий краситель в цитратном буфере. О наличии белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, образующейся после контакта индикатора с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи.
Данный метод имеет ряд преимуществ - простота и скорость выполнения методики, по сравнению с остальными, однако есть и серьезные недостатки. Один из них- повышенная чувствительность индикатора к альбуминам, по сравнению с другими белками. Поэтому тест-полоски, по большему счету предназначены для обнаружения селективной гломерулярной протеинурии, при которой в основном весь белок мочи представлен альбумином.
Когда происходит прогрессирование заболевания и преобразование селективной протеинурии в неселективную, а именно появление в моче глобулинов, данный метод искажает действительное значение белка в моче. Показатели являются резко заниженными. Таким образом, использование данного метода для оценки состояния гломерулярного аппарата почек в динамике не представляется возможным. Неточность в определении белка присутствует также и при тубулярной протеинурии. Диагностические полоски являются относительно нечувствительным методом и не позволяют определять концентрацию белка в моче, ниже чем 0,15 г/л. Стоит отметить, что отрицательные показатели полосок не доказывают отсутствие в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.
При наличии в моче слизи, большого количества гликопротеидов индикаторная зона может реагировать на них и давать ложноположительные результаты. Также они могут давать ложные результаты при высокой концентрации мочевины.
В связи с указанными выше недостатками, метод диагностических полосок является малоэффективным, и также может применяться только для скрининга. Результаты, полученные этими методами, не являются достоверными и могут рассматриваться только в качестве ориентировочных.
Таким образом можно сделать вывод, что качественные и полуколичественные методы не обладают хорошей эффективностью, а лишь являются приблизительными. Они не могут использоваться для отслеживания динамики заболевания и эффективности проводимого лечения, а также не всегда достоверно отражают степень поражения почек и дают ложноположительные результаты. Многие из них являются неудобными в использовании и требуют относительно много времени на своё выполнение. Наиболее широко распространённым из них является метод диагностических полосок, в связи с лёгкостью его применения.
Количественные методы определения белка в моче.
Точное определение количества белка в моче в некоторых случаях является достаточно сложной задачей. Эта сложность определяется рядом нескольких факторов:
1.В моче здорового человека зачастую присутствует небольшое количество белка, являющееся нормой. Многие методы оценки обладают высокой чувствительностью и улавливают это значение, показывая положительный результат.
2.Кроме белка, в моче имеется множество веществ, которые способны нарушать ход химических реакций метода и приводить к ложным результатам.
3. Серьёзные различия состава и количества белков мочи, в зависимости от имеющегося у человека заболевания, затрудняют выбор нужного калибровочного материала.
В клинических лабораториях обычно используются «рутинные» методы определения белка в моче, но они также не всегда дают достоверные результаты.
Требования, предоставляемые к количественным методам определения белка в моче:
- Метод должен быть прост в своём выполнении, не требовать большого количества времени и высокой квалификации специалиста.
-Обладать высокой чувствительностью, надёжностью и эффективностью.
-Иметь линейную зависимость между поглощением образовавшегося в процессе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, это необходимо для упрощения подготовки мочи к исследованию.
-Не требовать дорогостоящих реактивов и устройств для своего выполнения.
-Обладать устойчивостью к воздействию факторов среды.
-Не зависеть от состава мочи.
К сожалению, ни один из существующих методов количественного определения белка не является идеальным и отвечающим всем этим требованиям, однако количественные методы более совершенны, чем качественные.
Все количественные методы делятся на турбодиметрические и колориметрические.
К турбидиметрическим методам относятся:
- определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
- определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
- определение белка с бензетоний хлоридом.
В основе данных методов лежит снижение растворимости белка и образование суспензии из взвешенных частиц, под действием преципитирующих факторов.
Содержание белка оценивается по интенсивности рассеивания света, которое определяется числом светорассеивающих частиц. Такой метод анализа называется нефелометрическим. Если же оценка идёт по ослаблению светового потока, после образования суспензии метод называется турбидиметрическим.
Степень рассеивания света в данных методах зависит от многих факторов, например, от скорости смешения реактивов, температуры, pH среды, наличия в моче дополнительных веществ, а также самих способов фотометрии.
Для того, чтобы сделать данные методы максимально эффективными необходимо тщательно соблюдать все условия проведения анализа.
На достоверность результатов, полученных данным методом, могут повлиять различные лекарственные препараты, например, антибиотики или рентгенконтрастирующие вещества. При их применении реакция может показать ложноположительный, либо ложноотрицательный результат.
Еще одним недостатком турбодиметрических методов является сложность их стандартизации, из-за этого не редко получаются ошибочные результаты.
Превосходством данных методов над другими является относительная дешевизна и доступность реактивов, а также скорость выполнения. Поэтому они широко используются в современной медицинской практике, в большинстве случаев используется сульфосалициловый метод.
Колориметрические методы.
Являются самыми точными и наиболее чувствительными, в их основе лежат специфические цветные реакции белков.
К ним относятся:
- Биуретовая реакция,
-Метод Лоури,
-Методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
1. Понсо S (Ponceau S),
2. Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
3. Пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).
Биуретовая реакция является одним из самых надёжных методов и позволяет выявить белок в различных диапазонах концентраций. С помощью неё можно определить многие белковые фракции: альбумины, глобулины, парапротеины со сравнимой чувствительностью. Однако, данный метод является неудобным в исполнении и включает в себя большое количество процессов. Поэтому биуретовая реакция используется только в специализированных нефрологических отделениях, в случаях, когда результаты, полученные другими методами, вызывают сомнение. Кроме этого, данным методом определяют величину потери белка за сутки у пациентов с заболеваниями почек.
Метод Лоури является ещё более чувствительным, чем биуретовый. Он включает в себя биуретовую реакцию и реакцию Фолина на определение триптофана и тирозина в структуре белковой молекулы. К сожалению, у этого метода тоже есть недостаток, он заключается в неспецифическом взаимодействии реактива с небелковыми компонентами мочи. Если же очистить мочу от ненужных веществ с помощью диализа, можно использовать метод Лоури с наибольшей эффективностью и получать максимально достоверные результаты.
Методы, основанные на способности красителей связывать белок также обладают хорошей чувствительностью и простотой выполнения, однако они недостаточно широко распространены в лабораториях. Причина этому- высокая стоимость реактивов. Наиболее популярным из них является метод с пирогалловым красным.
Так как все методы определения белка имеют свои недостатки, рекомендуется определять белок двумя разными способами, а потом рассчитывать значение по формулам.
Глава 2. Методы определения глюкозы в моче.
2.1.Качественные методы определения глюкозы в моче.
Большинство качественных проб, применяемых для определения глюкозы в моче, основано на редукционных свойствах альдегидной группы глюкозы. Как окислитель используют легко редуцирующуюся соль, при взаимодействии с которой получается окрашенное вещество.
Выделяют следующие пробы: Фелинга, Гайнеса, Ниландера, Бенедикта, глюкозооксидазную пробу.
Глюкозооксидазная проба
В её основе лежит действие глюкозооксидазы, фермента, окисляющего глюкозу. При этом образуется перекись водорода, которая расщепляется пероксидазой и окисляет индикатор, после чего он изменяет свой цвет.
Для определения глюкозы в моче данным способом, используют специальную индикаторную бумагу, погружая её в мочу на 1-2 секунды. Через несколько минут определяют наличие глюкозы в моче и ее концентрацию, сравнивая цвет индикатора с цветовой шкалой.
Данный метод определения глюкозы является очень простым в исполнении, однако не обладает высокой точностью и достоверностью. Например, при большом содержании глюкозы в моче интенсивность окраски не изменяется. Подходит для скрининга анализов мочи.
Проба ГайнесаОснована на способности глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в щелочной среде в гидрат закиси меди, а затем в закись меди (красного цвета).
Для проведения пробы к 4 мл реактива добавляют 9-12 капель мочи до тех пор, пока не появится голубое окрашивание. Затем нагревают верх пробирки до кипения над пламенем горелки. В данном случае нижняя часть пробирки является контрольной, по ней определяют яркость перехода цвета от голубого в жёлтый.
Проба Гайнеса достаточно надежный метод, потому что происходит сильное разведение мочи и исключается влияние на ход реакций других компонентов мочи (мочевой кислоты, креатина, желчных пигментов и некоторых лекарственных средств). Искажать результаты может только содержание большого количества белка, поэтому лучше исключить его перед проведением пробы Гайнеса. Данный метод, несмотря на его надежность весьма трудоёмкий и требует больших затрат времени и реактивов.
. Количественные методы определения глюкозы в моче.
Колориметрический метод определения глюкозы в моче по АльтгаузенуЗаключается в нагревании мочи, содержащей глюкозу со щелочью с получением цветной реакции. Для этого берут 4 мл мочи и добавляют к ней 1 мл едкого натра 10%. Спустя 10 минут, после начала нагревания сравнивают цвет жидкости с цветной шкалой. На против каждого цвета, указано процентное содержание глюкозы в моче.
Способ Альтгаузена не даёт точных результатов, с помощью него можно определить концентрацию глюкозы лишь ориентировочно. Еще одним недостатком является длительность проведения метода и затраты дефицитных реактивов. Применяется только при отсутствии поляриметра.
В настоящее время существует модифицированный метод Альтгаузена, который исключает все недостатки и является достаточно быстрым и легким в исполнении, благодаря чему применяется в клинической практике.
Техника определения:
К 4 мл мочи добавляют 1 мл 10% раствора едкого натра, затем ставят на водяную баню на 3 мин. Через 10 мин пробу колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с рабочей шириной 5 мм. В качестве контроля берут воду. Уровень содержания глюкозы в моче определяют по калибровочной кривой, составленной ранее. Следует отметить, что мочу перед определением глюкозы необходимо перемешать и при высоких концентрациях глюкозы в пробе (4–5 %) ее необходимо развести.
Цветная реакция с ортотолуидином.
Основана на цветной реакцией глюкозы с ортотолуидином при нагревании. Интенсивность окраски будет пропорциональна концентрации глюкозы в моче.
Для осуществления метода мочу разводят в 2–10 раз, после чего смешивают 0,1 мл мочи с 4,5 мл ортотолуидинового реактива, ставят пробирку на 8 мин в кипящую водяную баню, затем быстро охлаждают до комнатной температуры. Полученный цветной раствор колориметрируют на ФЭКе при длине волны 590– 650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля, который ставят также, но вместо мочи берут стандартный раствор глюкозы. Метод является достаточно простым в исполнении, автоматизированным, на его эффективность не оказывает влияния наличие в моче белка. Поэтому очень часто используется в медицинских лабораториях.
Поляриметрический способ определения глюкозы в моче
Метод заключается в определении концентрации глюкозы в моче с помощью сахариметра. Принцип определения основан на том, что глюкоза, находящаяся в растворе, вращает плоскость поляризованного света пропорционально содержанию глюкозы в растворе. Перед исследованием необходимо очистить мочу от белка и профильтровать. Если моча после фильтрования остается мутной, то применяют адсорбент. Трубку поляриметра заполняют просветленной мочой, накрывают шлифованным стеклом, завинчивают и отправляют в аппарат. По интенсивности затемнения правой половины поля зрения поляриметра определяют угол отклонения поляризованного луча, что выражается в градусах шкалы прибора. Угол отклонения в 1° соответствует 1 % глюкозы (при длине трубки 18,94 см).
В настоящее время данный способ практически не используется, потому что имеет много недостатков: субъективность, трудоёмкость, низкая эффективность при неполной прозрачности мочи.
Заключение.
В ходе нашего исследования было выяснено, что имеется большое количество различных методов по определению белка и глюкозы в моче, однако среди них невозможно выявить один, наиболее подходящий во всех ситуациях. Качественные и полуколичественные методы определения белка в моче являются приблизительными и дают лишь ориентировочные результаты, с их помощью невозможно оценивать эффективность проводимого лечения, а также определить степень поражения почек. Однако, некоторые из них (диагностические полоски) обладают особой быстротой и лёгкостью выполнения, поэтому могут быть использованы в клинической практике для скрининга. Если диагностические полоски показывают положительный результат необходима дополнительная проверка количественными методами. Тоже самое можно сказать о качественных методах определения глюкозы, наиболее популярным из которых является глюкозооксидазный тест.
Что же касается количественных методов определения глюкозы и белка в моче- они являются достаточно эффективными и достоверными. Большинство из них автоматизированы и выполняются с помощью специальных приборов, что также является их плюсом. Однако, данные методы тоже имеют ряд недостатков: сложность выполнения, требуют больше времени, для некоторых, необходимы затраты большого числа реактивов. Количественные методы больше подходят для анализа мочи в специализированных нефрологических отделениях, при ведении пациентов с заболеваниями почек, либо подозрении на сахарный диабет.
Таким образом можно сделать вывод, что выбор метода определения тех или иных веществ в моче зависит от конкретной ситуации. Во-первых, от заболевания пациента и цели проводимого исследования, а во-вторых от наличия необходимых приборов и реактивов для его проведения. Не существует единого «золотого стандарта» как в определении белка, так и глюкозы в моче.
Список литературы
1. О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
2. В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», - Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
3.Филь А.А., Бондарь Т.П., Званская А.М. «Сравнительная характеристика методов определения белка в моче» -Новое слово в науке: перспективы развития. 2015. № 2 (4). С. 80-82.
4. Лихоносова А.П., Лихоносов М.П. «Сравнительный анализ методов, применяемых для ранней диагностики сахарного диабета» - Клиническая эндокринология и эндокринная хирургия. 2012. № 1 (38). С. 68-76.
5. А. В. Козлов, "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.